天津科技大学分子生物学复习总结(3)

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2. 5 .2 DNA的修复
由于染色体DNA在生命过程中占有至高无上的地位，DNA复制的准确性以及DNA日常保养中的损伤修复就有着特别重要的意义。
大肠杆菌中DNA的修复系统：错配修复（回复错配）碱基切除修复（切除突变的碱基）核苷酸切除修复(修复被破坏的DNA) DNA直接修复（修复嘧啶二体或甲基化DNA）
2.5.2.1 错配修复（mismatch repair）
错配修复对DNA复制忠实性的贡献力达102-103，DNA子链中的错配几乎完全能被修正。
该系统识别母链的依据来自Dam甲基化酶，它能使位于5’GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。一旦复制叉通过复制起始位点，母链就会在开始DNA合成前的几秒种至几分钟内被甲基化。
只要两条DNA链上碱基配对出问题，错配修复系统就会根据“保存母链，修正子链”的原则，找出错误碱基所在的DNA链，并在对应于母链甲基化腺苷酸上游鸟苷酸的5’位置切开子链，再启动特定的修复途径，合成新的子链片段。
2.5.2.2 碱基切除修复（Base-excision repair）
所有细胞中都带有能识别受损核酸位点的不同的糖苷水解酶，能特异性切除受损核苷酸上的N-β糖苷键，形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。
2.5.2.3 核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair）
当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，则由核苷酸切除修复系统负责修复。
在原核生物中受损核苷酸3’端的第5位，5’端的第8位磷酸糖苷分别被DNA切割酶切开。在人类细胞中，受损伤核苷酸3’端第6位，5’端的第23位磷酸糖苷键分别被DNA切割酶切开。
2.5.2.4 DNA的直接修复（direct repair）
生物体内还存在DNA损伤直接修复而并不需要切除碱基或核苷酸的机制。
DNA光解酶（photolyase）能把在光下或经紫外光照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体及6-4光化物（6-4-photoproduct）还原成为单体。
O6-甲基转移酶使O6甲基化鸟嘌呤恢复成鸟嘌呤
课外作业掌握DNA突变和修复的类型
2.6 DNA的转座（DNA Transposition）
DNA的转座，或称移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介导的遗传物质重排现象。
2.6.1 转座子的分类和结构特征转座子
（transposon，Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列（insertional sequence，IS），它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。
常见的IS序列都是很小的DNA片段（约1kb），末端具有倒置重复序列，转座时常复制宿主靶位点4～15bp的DNA形成正向重复区。
大部分IS序列只有一个开放读码框，翻译起点紧挨着第一个倒置重复区，终止点位于第二个倒置重复区或附近。
IS1含有两个分开的读码框，只有移码通读才能产生功能型转座酶。
复合式转座子（composite transposon）是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列。
一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。
除了末端带有IS序列的复合转座子以外，还存在一些没有IS序列的、体积庞大的转座子（5 000bp以上）——TnA家族。常带有3个基因，一个编码β-内酰胺酶（AmpR），另两个则是转座作用所必须的。所有TnA类转座子两翼都带有38bp的倒置重复序列。
2.6.2 转座作用的机制
转座发生时，受体分子中有一段很短的（3～12bp）、被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。
不同转座子的靶序列长度不同，但特定转座子所复制的靶序列长度是一样的。IS1两翼总有9个碱基对的靶序列，而Tn3两端总有5bp的靶序列。
在复制性转座中，整个转座子被复制，所移动的仅仅是原转座子的拷贝。转座酶（transposase）和解离酶（resolvase）分别作用于原始及复制转座子。TnA类主要是这种形式。
在非复制性转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以这种方式进行转座。
2.6.3 转座作用的遗传学效应
①转座引起插入突变，导致结构基因失活。
②转座产生新的基因。
③转座产生的染色体畸变。
④转座引起生物进化。由于转座作用，使某些原来在染色体上相距甚远的基因组合到一起，构建成新的表达单元，产生新的基因和蛋白质分子。
2.6.4 真核生物中的转座子
1 )玉米中的控制因子（controlling element）
转座子玉米中的控制因子分为两类，即自主性因子和非自主性因子。
前者具有自主剪接和转座的功能；后者单独存在时是稳定的，不能转座，当基因组中存在与非自主性因子同家族的自主性因子时，它才具备转座功能。
同一家族的自主性因子能为非自主性因子的转座提供反式作用蛋白（转座酶）。
在著名的Ac-Ds体系中，自主转座子Ac长4 563bp，转录生成3 500bp的单一成熟RNA。Ac转座子的两翼有11bp的倒转重复序列，在其靶DNA位点复制形成8bp正向重复。
已知所有Ds都是Ac转座子的缺失突变体，其两端有完整的转座特征序列。
Spm（suppressor-mutator）和En（enhancer）属于另一类转座子。
Spm和En几乎是完全相同的，它们只有不到10个碱基的差异，两端各有一个13bp的倒置重复序列，在其靶DNA位点复制形成3bp正向重复。
Spm和En的转录区（即tnpA基因）有8300bp，成熟mRNA为2500bp。
tnpA基因产物的主要功能是切割转座子序列。另有两个开放读码框位于tnpA基因的内含子中，其mRNA的含量大约只有tnpA基因产物的1%。
由tnpB基因编码的这两个蛋白可能直接与转座子两端13bp倒转重复区相结合，有利于DNA的切割和转移。所有dSpm（defectiveSpm）都是功能型Spm的缺失突变体。
2 )果蝇中的转座子(了解)
果蝇中的Copia转座子具有数百bp的末端正向重复和类似于酵母Ty转座子及RNA肿瘤前病毒的结构，能以高速度转录并产生有多聚腺苷化末端的RNA。
只具有一个长的可阅读框架，基因产物与RNA肿瘤病毒逆转录酶有较高的同源性。
P转座子（P element）属于非复制型，两翼都有31bp倒置重复序列，转座后导致靶DNA复制产生8bp正向重复序列。
有实验证明，P转座子插入果蝇基因组W位点引起杂种不育。
课外作业掌握转座子的类型、遗传学效应及其可能的应用。
第三章生物信息的传递（上）从DNA到RNA
基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生物学功能是以蛋白质的形式表达出来的。DNA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存，并通过转录生成信使RNA，翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。
基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。
转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。
翻译是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码子翻译成氨基酸序列、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。
DNA分子中的核苷酸排列顺序不但决定了胞内所有RNA及蛋白质的基本结构，还通过蛋白质（酶）的功能间接控制了细胞内全部有效成份的生产、运转和功能发挥。
与mRNA序列相同的那条DNA链是编码链（coding strand）或称有意义连（sense strand），另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链则被称为模板链（template strand）或称反义链（antisensestrand）。
DNA和RNA虽然很相似，只有T或U及核糖的第二位碳原子上有所不同，但它们的生物学活性却很不同。
RNA主要以单链形式存在于生物体内，其高级结构很复杂，它们既担负着贮藏及转移遗传信息的功能，又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能。
因为只有mRNA所携带的遗传信息才被用来指导蛋白质生物合成，所以人们一般用U、C、A、G这4种核苷酸而不是T、C、A、G的组合来表示遗传性状。
生物体内拥有三类RNA，即：编码特定蛋白质序列的mRNA；能特异性解读mRNA 中的遗传信息并将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的tRNA；直接参与核糖体中蛋白质合成的rRNA。
3. 1 RNA的转录
3. 1. 1 转录的基本过程
无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：模板识别转录起始通过启动子转录的延伸和终止。
大肠杆菌中依赖于DNA的RNA转录过程图示。转录泡中单链DNA的长度约在17bp左右，被聚合酶复合物所保护的DNA序列约为35bp左右。
模板识别阶段主要指RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。转录起始前，启动子附近的DNA双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。
转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。
转录起始后直到形成9个核苷酸短链是通过启动子阶段，此时RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与DNA模板链的结合不够牢固，很容易从DNA链上掉下来并导致转录重新开始。
一旦RNA聚合酶成功地合成9个以上核苷酸并离开启动子区，转录就进入正常的延伸阶段。所以，通过启动子的时间代表一个启动子的强弱。
一般说来，通过启动子的时间越短，该基因转录起始的频率也越高。
RNA聚合酶离开启动子，沿DNA链移动并使新生RNA链不断伸长的过程就是转录的延伸。大肠杆菌RNA聚合酶的活性一般为每秒50-90个核苷酸。随着RNA聚合酶的移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3’末端不断延伸，在解链区形成RNA-DNA杂合物。
真核生物RNA聚合酶不能直接识别基因的启动子区，需要一些被称为转录调控因子的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上，RNA聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物（preinitiationtranscription complex, PIC），以保证有效地起始转录。
37℃时，转录生成mRNA的速度大约是每分钟2500个核苷酸，即每秒钟合成14个密码子，而蛋白质合成的速度大约是每秒钟15个氨基酸。正常情况下，从一个基因开始表达到细胞中出现其mRNA的间隔约为2.5分钟，而再过半分钟就能在细胞内测到相应的蛋白质。
3. 1. 2 转录机器的主要成分
1) RNA聚合酶
RNA聚合酶是转录过程中最关键的酶，主要以双链DNA为模板，以4种核苷三磷酸作为活性前体，并以Mg2+/Mn2+为辅助因子，催化RNA链的起始、延伸和终止，它不需要任何引物，催化生成的产物是与DNA模板链相互补的RNA。
RNA或RNA-DNA双链杂合体不能作为模板。
原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都能催化RNA的合成，但在其分子组成、种类和生化特性上各有特色。
大多数原核生物RNA聚合酶的组成是相同的，大肠杆菌RNA聚合酶由2个α亚基、一个β亚基、一个β’亚基和一个ω亚基组成，称为核心酶。加上一个σ亚基后则成为聚合酶全酶（holoenzyme），相对分子质量为4.65×105。
α亚基可能与核心酶的组装及启动子识别有关，并参与RNA聚合酶和部分调节因子的相互作用。
T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰，造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力降低。
由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心，它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的两个大亚基有同源性。β亚基能与模板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相结合。
σ因子的作用是负责模板链的选择和转录的起始，它是酶的别构效应物，使酶专一性识别模板上的启动子。核心酶在T7噬菌体DNA上约有1300个结合位点，平均结合常数为2×1011。
σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍，酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。
σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的半衰期小于1秒。
真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核中的位置不同，负责转录的基因不同，对α-鹅膏覃碱的敏感性也不同。
真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所组成，相对分子质量超过5×105。
真核生物RNA聚合酶的主要特征：
聚合酶中有两个相对分子质量超过1×105的大亚基；

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