天津科技大学分子生物学复习总结(6)

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4. 3. 3 核糖体的功能
在多肽合成过程中，由不同的tRNA将相应的氨基酸带到蛋白质合成部位，并与mRNA进行专一性的相互作用，以选择对信息专一的AA-tRNA。核糖体还必须能同时容纳另一种携带肽链的tRNA，即肽基tRNA（peptidyl-tRNA），并使之处于肽键易于生成的位置上。
核糖体上至少有5个活性中心，即mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位（A位）、结合或接受肽基tRNA的部位、肽基转移部位（P位）及形成肽键的部位（转肽酶中心）。此外，还应有负责肽链延伸的各种延伸因子的结合位点。
核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，大亚基负责携带氨基酸及tRNA的功能，肽键的形成、AA-tRNA、肽基-tRNA的结合等，A位、P位、转肽酶中心等主要在大亚基上。
课外作业掌握密码子概念和核糖体的结构和功能。
4. 4 蛋白质合成的生物学机制
核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，转移RNA是模板与氨基酸之间的接合体。蛋白质合成是一个需能反应。真核生物中可能有近300种生物大分子参与蛋白质的生物合成，这些组分约占细胞干重的35%。
细胞用来进行合成代谢总能量的90%消耗在蛋白质合成过程中。大肠杆菌只需要5-6秒钟就能合成一条由100个氨基酸组成的多肽。蛋白质的生物合成包括氨基酸活化、肽链的起始、延伸、终止以及新合成多肽链的折叠和加工。
4.4.1 氨基酸的生物学特性与生物合成
高等动物不能合成大约一半氨基酸，只能从食物中获取这些必需氨基酸（Essential）。
谷氨酰胺合成酶是氮代谢中的主要调控位点。铵通过谷氨酸→谷氨酰胺被结合到有机物质中。主要有两步反应：
(1)glutamate+ATP→γ-glutamyl phosphate+ADP
(2) γ-glutamyl phosphate+NH4+→glutamine+ADP+Pi+H+
总结glutamate+ NH4++ATP→glutamine+ADP+Pi+H+
4. 4. 2 氨基酸的活化
蛋白质合成的起始是指在模板mRNA编码区5‘端形成核糖体-mRNA-起始tRNA复合物并将甲酰甲硫氨酸放入核糖体P位点。原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。
真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80S•mRNA•Met-tRNAMet起始复合物。
起始复合物的生成除了GTP外，还需要Mg2+、NH4+及3个起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。
4.4.3 翻译的起始
第一步，30S小亚基与翻译起始因子IF-1，IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板相结合。
第二步，fMet-tRNAfMet在IF-2的协同下进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。
第三步，带有tRNA、mRNA、三个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，释放翻译起始因子。
细菌核糖体上一般存在三个与氨基酰-tRNA结合的位点，即A位点（aminoacyl site），P位点（peptidyl site）和E位点（Exit site）。只有fMet-tRNAfMet能与第一个P位点相结合，其它所有tRNA都必须通过A位点到达P位点，再由E位点离开核糖体。
真核生物蛋白质生物合成的起始基本与原核生物相同，只不过其核糖体较大，有较多的起始因子，mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5’端的“帽子”和3’端的多聚A都参与形成翻译起始复合物（图4-14）
4. 4. 4 肽链的延伸
生成起始复合物，第一个氨基酸（fMet/Met-tRNA）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式（图4-15）被有序地结合上去。
肽链延伸中的每个循环都包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位三步。
4. 4. 5 肽链的终止
当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键，释放新生的肽链和tRNA，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。
释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。
细菌细胞内存在三种终止因子（或称释放因子，RF1，RF2，RF3），RF1能识别UAG和UAA，RF2识别UGA和UAA。一旦RF与终止密码相结合，它们就能诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。RF3可能与核糖体的解体有关。真核细胞只有一个（RF）终止因子。
4. 4. 6 蛋白质前体的加工
1)N端fMet或Met的切除
无论原核生物还是真核生物，N端的甲硫氨酸往往在多肽链合成完毕前就被切除。50%的真核蛋白中，成熟蛋白N端残基会被N-乙基化。
2)二硫键的形成
mRNA中没有胱氨酸密码子，而不少蛋白质都含有二硫键。蛋白质合成后往往通过两个半胱氨酸的氧化作用生成胱氨酸。
3)特定氨基酸的修饰
氨基酸侧链的修饰作用包括磷酸化（如核糖体蛋白质）、糖基化（如各种糖蛋白）、甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质）、乙基化（如组蛋白）、羟基化（如胶原蛋白）和羧基化等，图4-20是生物体内最普通发生修饰作用的氨基酸残基及其修饰产物。
糖蛋白主要是蛋白质侧链上的天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基加上糖基形成的，胶原蛋白上的脯氨酸和赖氨酸多数是羟基化的。实验证明，内质网可能是蛋白质N-糖基化的主要场所4. 4. 7 蛋白质合成抑制剂(了解)
蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等。
此外，5-甲基色氨酸、环已亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白都能抑制蛋白质的合成。
链霉素是一种碱性三糖，能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。若以多聚（U）作模板，则除苯丙氨酸（UUU）外，异亮氨酸（AUU）也会被掺入。链霉素的作用位点在30S亚基上。
青霉素、四环素和红霉素只与原核细胞核糖体发生作用，从而阻遏原核生物蛋白质的合成，抑制细菌生长。
氯霉素和嘌呤霉素既能与原核细胞核糖体结合，又能与真核生物核糖体结合，妨碍细胞内蛋白质合成，影响细胞生长。
4. 5 蛋白质运转机制（了解）
由于细胞各部分都有特定的蛋白质组分，因此合成的蛋白质必须准确无误地定向运送才能保证生命活动的正常进行。
若某个蛋白质的合成和运转是同时发生的，则属于翻译运转同步机制；若蛋白质从核糖体上释放后才发生运转，则属于翻译后运转机制。这两种运转方式都涉及到蛋白质分子内特定区域与细胞膜结构的相互关系。
4. 5. 1 翻译-运转同步机制
蛋白质定位信息存在于自身结构中，并通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。信号序列在结合核糖体上合成后便与膜上特定受体相互作用，产生通道，允许这段多肽在延长的同时穿过膜结构（图4-28）。因此，这种方式是边翻译边跨膜运转。
绝大部分被运入内质网内腔的蛋白质都带有一个信号肽，位于蛋白质的氨基末端（13-36个残基）：（1）一般带有10-15个疏水氨基酸；（2）在靠近该序列N-端常常有1个或数个带正电荷的氨基酸；（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸，离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨酸）。
分泌蛋白的生物合成开始于结合核糖体，翻译进行到50～70个氨基酸残基时，信号肽从核糖体的大亚基上露出，与粗糙内质网膜上的受体相结合。
信号肽过膜后被水解，新生肽随之通过蛋白孔道穿越疏水的双层磷脂。一旦核糖体移到mRNA的“终止”密码子，蛋白质合成即告完成，翻译体系解散，膜上的蛋白孔道消失，核糖体重新处于自由状态。
SRP（信号识别蛋白）能同时识别需要通过内质网膜进行运转的新生肽和自由核糖体，并导致该多肽合成的暂时终止（此时新生肽一般长约70个残基左右）。SRP-信号肽-多核糖体复合物即被引向内质网膜并与SRP的受体——DP（停靠蛋白，又称SRP受体蛋白）相结合。
4. 5. 2 翻译后运转机制
1）线粒体蛋白质跨膜运转
①通过线粒体膜的蛋白质运转之前大多数以前体形式存在，由成熟蛋白质和位于N端的20～~80个残基的前导肽（leader peptide）组成；
②蛋白质跨线粒体内膜运转是一种需能过程；
③蛋白质跨线粒体膜运转时，首先由外膜上的Tom受体复合蛋白识别与Hsp70或MSF等分子伴侣相结合的待运转多肽，通过Tom和Tim组成的膜通道进入线粒体内腔。
2）前导肽的作用与性质
带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，分散于不带电荷的氨基酸序列之间；
缺少带负电荷的酸性氨基酸；
羟基氨基酸含量较高；
有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）α-螺旋结构的能力。
前导肽跨膜运转时首先与线粒体外膜上的受体相结合。Tom受体可能是线粒体蛋白质跨膜运转时最主要的受体蛋白。有些前导肽含有“止运入”肽段，当该肽段被跨膜通道中的受体蛋白识别时，所运输的多肽将被定位在膜上。
3）叶绿体蛋白质的跨膜运转
叶绿体多肽在胞质中的游离核糖体上合成后脱离核糖体并折叠成具有三级结构的蛋白质分子，多肽上某些特定位点结合于只有叶绿体膜上才有的特异受体位点。叶绿体定位信号肽一般有两个部分，第一部分决定该蛋白质能否进入叶绿体基质，第二部分决定该蛋白能否进入类囊体。
4. 5. 3 核定位蛋白的运转机制
为了核蛋白的重复定位，这些蛋白质中的信号肽——被称为核定位序列（NLS—Nuclear Localization Sequence）一般都不被切除。NLS可以位于核蛋白的任何部位。蛋白质向核内运输过程需要核运转因子（Importin）α、β和一个低分子量GTP酶（Ran）参与。
α和β组成的异源二聚体是核定位蛋白的可溶性受体，与核定位序列相结合的是α亚基。这些蛋白组成的复合物停靠在核孔处，依靠Ran GTP酶水解GTP提供的能量进入细胞核，α和β亚基解离，核蛋白与α亚基解离，α和β分别通过核孔复合体回到细胞质中，起始新一轮蛋白质运转。
4.5.4 蛋白质的降解
蛋白质降解是一个有序的过程。在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。
蛋白质的半衰期从30秒到许多天不等。大部分真核蛋白的半衰期为数小时至数天。成红细胞=110天。真核蛋白的降解依赖于一个只有76个氨基酸残基、其序列高度保守的泛蛋白（Ubiquitin）。细胞内即将被降解的蛋白首先在ATP的作用下与泛蛋白相连，并将该复合体运送到特定的蛋白降解体系中直到完全降解。
成熟蛋白N-端的第一个氨基酸（除已被切除的N端甲硫氨酸之外，但包括翻译后修饰产物）在蛋白的降解中有着举足轻重的影响。
当某个蛋白质的N端是甲硫氨酸、苷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸时，表现稳定。其N端为赖氨酸、精氨酸时，表现最不稳定，平均2-3分钟就被降解了。
课外作业掌握蛋白质合成的生化过程。
第五章分子生物学基本研究法(了解原理和实验过程)
从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。
5. 1 重组DNA技术发展史上的重大事件
三大成就：
一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。

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