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二.习题分析及自测题
一、在做某一多肽样品的一级结构分析时，样品与DNFB反应，再经酸水解得到DNP-Asn；将样品进行氨基酸组成分析，得到如下结果：
A -5F -1K-2P-3T -1C -2G -3L -2Q-1V-1D-3H -2M -2R-1W-2E-0I-3N-2S-2Y-0
根据以上信息你能得出哪些结论?(1996年，北医)
考点：多肽链中氨基酸序列分析即蛋白质一级结构测定。
解析：本题具有一定难度，首先应知道氨基酸的单符号英文名缩写，比如K代表赖氨酸，其次应掌握氨基酸序列分析的基本步骤及原理，各步常用的化学试剂和酶，比如本题中K-2要知道这是在氨基酸组成分析中表示有2个赖氨酸残基，再如要知道DNFB是用在哪一步上，作用是什么，才能得出相应的结论。
答案：1.从题目所给氨基酸组成分析的结果：K-2表示有2个赖氨酸残基，R-1表示有1个精氨酸残基，其他同理，我们可知道多肽链中氨基酸残基的种类和数目，该肽链共有38个氨基酸组成。
2.DNFB即二硝基氟苯，用于氮末端氨基酸分析，题中样品与DNFB反应，再经酸水解得到DNP-Asn，说明此肽链N末端氨基酸为Asn(天冬酰胺)。
3.对于氨基酸序列分析，常需先将整条肽链切成小的肽段，常用的胰蛋白酶法水解赖氨酸(K)或精氨酸(R)的羧基形成的肽键，溴化氰法水解甲硫氨酸(M)羧基侧的肽键，胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸(F、W、Y)羧基侧的肽键，所以此题中如果这些氨基酸残基都不在碳末端的话，下一步如果用胰蛋白酶将切在1个R和2个K羧基侧肽键，形成4个肽段，同理若用溴化氰，因为M有2个，将得到3个片段，用胰凝乳蛋白酶酶切，因为F有1个，W有2个，Y为0个，也将得到4个片段。(1996年北医)
二、说明酶的结构与功能的关系
考点：酶的分子结构与功能
解析：1.酶的分子组成：分单纯酶和结合酶，其中结合酶的酶蛋白部分决定反应的特异性，辅助因子部分决定反应的种类与性质。
2.酶分子的结构与功能：酶分子中与酶的活性密切相关的基团称必需基团。一些必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将其转化为产物，这一区域即为酶的活性中心，酶分子中各种结构基团与其功能关系如下：
 
三、如何从血液中分离纯化清蛋白(MW：68500，PI＝4.9)?请举出两种分离纯化的方法，简要说明各种方法的基本原理及基本流程。(1998年，北医)
考点：蛋白质的分离与纯化
解析：分离纯化蛋白质的方法有多种，应利用蛋白质物理、化学性质的差异，选择合适的方法，将其分离纯化。如本题中可利用清蛋白分子量与其他蛋白不同的性质，采用凝胶过滤层析的方法，也可利用蛋白质沉淀的性质，采用盐析的方法，或利用其两性游离及等电点、分子大小等与其他蛋白的差异采用电泳的方法等。
答案：1.凝胶过滤层析：层析柱内填充带有网孔的凝胶颗粒，根据清蛋白分子量，选用合适大小网孔的凝胶，将血液加于柱顶端，以其所含的清蛋白球蛋白为例，清蛋白分子小进入凝胶孔内，球蛋白分子量大于网孔的分离上限，不进入孔内而直接流出，清蛋白因在孔内被滞留随后流出，从而清蛋白与球蛋白得以分离，而血液中含有的其他杂蛋白同理因其与清蛋白的分子大小的差异，可以与清蛋白分离，最终得到纯化的清蛋白。
2.盐析：硫酸铵等中性盐因能破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，故能使蛋白质发生沉淀，不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，盐析所需要的盐浓度也不同，从而将蛋白质得以分离。如用硫酸铵分离纯化清蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白即可从血清中沉淀析出而除掉，再加硫酸铵溶液至饱和，则清蛋白沉淀析出，从而清蛋白可以分离出来，再用透析，除去清蛋白中所含的硫酸铵，清蛋白即可被纯化。
四、酶的活性中心以外的结构有何作用(1998北医)
考点：酶的分子结构与功能
解析：酶的活性中心的作用是与底物结合并催化底物转化为产物，而其他活性中心以外的结构也是不可缺的，其主要作用如下：
1.活性中心外的一些基团为维持酶活性中心应有的空间构象所必需，是维系活性中心三维结构的骨架。
2.还可与作用物广泛性的结合，所释放的能量，可在热力学上推动反应的进行。
3.可决定酶促反应的特异性。
4.一些活性中心外的结构具有调节区，体内一些代谢物可与此调节部位特异结合，引起酶蛋白分子构象变化，从而影响酶与底物的结合，改变酶活性，这即为酶的变构调节。
五、牛胰核糖核酸酶能否水解pGpGpApGpApA序列，若能在何处水解，产物为何物?若不能说明原因(1993北医)
考点：核糖核酸酶的分类及作用机理
解析：水解核酸的酶称核酸酶，分RNA酶和DNA酶，也可从作用部位分内切核酸酶和外切核酸酶，一般性的内切核酸酶特异性较低，识别作用于某一种或多种核苷酸残基，牛胰核糖核酸酶，作用于RNA链中嘧啶核苷酸残基C-3′磷酸基与下一核苷酸残基C-5′的磷酸二酯键，将RNA链断裂。题中所给序列不含嘧啶核苷酸，故牛胰核糖核酸酶不能水解。
六、A：有份核酸样品，可能混有少许蛋白质，只允许定性测定一种元素即可确定其有无蛋白质污染，你选测哪一种元素，为什么?
B有多种方法可区分高分子量DNA与RNA分子，请写出一种最简便可行的分析方法，简要说明理由(1994北医)
考点：核酸的组成及性质
解析：A：要确定有无蛋白质污染，只须测定样品中是否含有只存在于蛋白质而不存在于核酸的元素，如果样品中有此元素存在，很明显说明存在蛋白质污染，满足此条件的是硫，核酸一般不合S，而大多数蛋白质含有S。
B：DNA与RNA一大区别在于DNA为双链结构，而RNA为单链结构，只在局部形成双链。故DNA在加热时，双链可解开，其260nm吸光度值会升高，而RNA即使加热变性，其260nm吸光值也变化不大，故可通过加热前后DNA与RNA在260nm处吸光值的变化来区分DNA和RNA。
七、某生物化学家发现并纯化了一种新的酶，纯化过程及结果如下表：
操作程序总蛋白(mg)活性(U)
1.粗提取200004000000
2.盐析沉淀50003000000
3.pH沉淀40001000000
4.离子交换层析200800000
5.亲和层析50750000
6.排阻层析45675000
根据表中结果：
a)计算每一步纯化程序后酶的比活性。
b)指出哪一步对酶的纯化最有效。
c)指出哪一步对酶的纯化最无效。
d)表中结果能否说明该酶已被纯化?若估计酶的纯化程度还需要做些什么?
e)若该单纯酶由682个氨基酸残基组成，该酶的分子量约为多少?(1997，北医)
考点：酶活力测定及酶的分离纯化。
解析：a)酶含量须用酶活力来表示，即在1分钟内转化1微摩尔的底物所需的酶量为一个单位，而每毫克酶蛋白所具有的酶活力，称比活力，用单位/毫克蛋白表示。
故每一步纯化程序后酶的比活性为1.4000000〖〗20000＝200(U/mg)
2.3000000〖〗5000＝600(U/mg)
3.1000000〖〗4000＝250(U/mg)
4.800000〖〗200＝4000(U/mg)
5.750000〖〗50＝15000(U/mg)
6.675000〖〗45＝15000(U/mg)
b)对同一种酶来说，比活力愈高，表明酶愈纯，从第4步到第5步酶的比活力明显提高，故亲和层析一步对酶的纯化最有效。
c)从第5步到第6步，酶的比活力无变化，所以第6步对酶的纯化最无效。
d)因为第5步和第6步的比活力一样，也就是说经过排阻层析后酶的纯度无变化，所以该酶基本上已被纯化。
e)一般每个氨基酸残基含一个氮原子，原子量为14，而每种蛋白质分子的含氮量都约为16%故，设蛋白质分子量为x，则14×682〖〗x＝16%，x=59675。
八、已知某多肽组成是Ala5、Lys1，Phe1与2，4-二硝基氟苯(DNFB)反应后再酸解产生一个游离的DNFB-Ala，胰蛋白酶解得一个三肽：Lys1,Ala2和一个四肽Ala3、Phe1，整个多肽经糜蛋白酶解产生一个六肽和一个游离氨基酸，写出这个多肽的一级结构(1992北医)
考点：氨基酸序列分析
解析：1.多肽与DNFB反应再酸解产生一个游离的DNFB-Ala，说明此肽的N末端氨基酸残基是Ala。
2.胰蛋白酸水解Lys、Arg羧基侧的肽键，题中多肽无Arg。且被此酸水解成一个三肽和一个四肽，说明第3位氨基酸残基是Lys。
3.糜蛋白酶水解Phe、Tyr、Trp羧基侧的肽键，此多肽中只存在Phe，且被此酶水解成一个六肽和一个游离氨基酸，说明其第6位氨基酸残基是Phe。
4.此多肽一共有7个氨基酸残基组成5个Ala，1个Lys，1个Phe，所以剩余的2、4、5、7位全是Ala。故此多肽一级结构为(从N端到C端)：Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Phe-Ala
九、磷酸酶、磷酸化酶、激酶、蛋白激酶有何区别?各举一例(1994北医)
考点：对酶定义的理解
解析：磷酸酶是将酶或蛋白质上磷酸基水解下来的酶，如磷蛋白磷酸酶可将磷酸化的糖原合酶上的磷酸基水解掉使其恢复活性。
磷酸化酶是将某一物质水解并将其磷酸化的酶，如糖原磷酸化酶是在糖原分解过程中从糖链上水解掉葡萄糖生成1-磷酸葡萄糖的酶。
激酶包括多种，能将ATP磷酸基转移给接受体的反应都由激酶催化，如己糖激酶即可催化葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖。
蛋白激酶也是激酶的一种，它多是在酶活性调节中发挥作用，将酶的丝氨酸、苏氨酸等残基磷酸化，发挥共价修饰作用，使其活性升高或降低，如蛋白激酶A可将糖原合成酶磷酸化使其失去活性。
十、从以下几方面对蛋白质及DNA进行比较(1999北医)
(1)分子组成(2)一、二级结构(3)主要生理功能
 
十一、叙述tRNA一、二级结构要点及其与当前已知的分子结构与功能的关系(1999北医)                      
考点：tRNA的分子结构与功能               
解析：tRNA一级结构：由核糖核苷  酸通过磷酸二酯键连成的单链分子
二级结构：核苷酸链中存在着一些局部互补配对的区域，可以形成局部双链，进而形成一种发夹结构，局部配对的双链构成茎状，中间不配对的部分膨出成环状，故其二级结构成三叶草形，左右两侧稀有碱基环称二氢尿嘧啶环和假尿嘧啶环，位于下方的称反密码环，此环中间3个碱基即为反密码子，3′端为CCA-OH末端。
与分子功能的关系：tRNA功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体并将其转呈给mRNA，具体来说靠其3′末端CCA-OH与氨基酸结合成氨基酰-tRNA，反密码子与mRNA上的密码子形成碱基互补，蛋白质生物合成时靠反密码子辨认mRNA上密码子，然后携带密码子编码的氨基酸至核蛋白体，参与蛋白质合成。
十二、(1)何谓酶蛋白、辅酶、活性部位?它们在酶催化反应中起何作用?
(2)何谓竞争性抑制?就酶反应动力学有关参数指出它与非竞争性抑制的区别(1999北医)
 

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