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双杂交系统主要应用于：①验证通过其他方法发现的蛋白质间可能的相互作用；②确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸；③筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质。

由于具有相对简便、快速及不经蛋白质纯化即可相接获得编码基因的特点，采用双杂交体系从cDNA文库和基因文库中直接筛选出蛋白质间相互作用成为它最具优势之处。

103 什么是包含体？纯化？

包含体是一类存在于胞浆中的不溶性物质，主要由“过度”表达的蛋白质致密地积聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露的结构。除蛋白质外，还有RNA聚合酶的四个亚基、一些外膜蛋白（out membranous protein, Omp）如OmpC、OmpA和OmpF的复合物、16S和23S rRNA以及一些闭合的和有缺口的DNA。这些物质在细菌的胞浆中构成高电子密度、折光性较强的颗粒，在相差和普通显微镜下均可见到。

形成包涵体可防止蛋白降解，有利于纯化，但带来的问题是表达的蛋白不具备生物活性，需经过变复性处理，而变复性的条件难以把握，复性率不高是制约其应用的关键因素。 分离纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白的步骤为：细胞破碎→包含体洗涤→包含体变性→蛋白复性→层析纯化。

基因工程表达的蛋白质有时会形成包含体,需要先分离包含体,裂解包含体后,再使蛋白质复性,才能形成天然构象.

以包含体形式表达的外源目的产物不具有物理活性, 必须溶解包含体进行复性, 才能得到具有生物活性的蛋白。在通常情况下, 包含体的表达具有可避免产物被蛋白酶降解, 包含体表达的目的蛋白常在大肠杆菌中高效表达, 目的蛋白的纯化相对容易, 能得到纯度较高的目的蛋白。包含体产物不具有生物活性, 包含体须经过变性、复性、纯化等手段才可得到目的蛋白。

104 Real time PCR原理？

Real time PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR根据所使用的荧光化学可分为荧光探针和荧光染料两种。现较常用的是TaqMan荧光探针技术，它具有高特异性和可靠性，实验结果稳定且重复性好。其原理简述如下：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团（Reporter）和一个淬灭荧光基团（Quencher）。探针完整时，报告基团发射的荧光信号

被淬灭基团吸收；在PCR反应的退火过程中，荧光探针和模板杂交。在延伸过程中，Taq酶的5'－>3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

105 融合蛋白及其应用？

融合蛋白是将两个或多个基因的编码区首尾连接,由同一调控序列控制构成的基因表达产物。

融合表达多采用分子伴侣作为融合伴体，由于分子伴侣在协助蛋白正确折叠方面具有重要功能，因而表达的融合蛋白多数是以可溶的、有活性的状态存在。同时利用融合伴体增添的一些特异性位点（如6组氨酸）也使纯化工作大为简化。鉴于这些特点，融合蛋白表达系统在蛋白功能研究方面具有重要意义。

在融合蛋白技术未出现前, 肿瘤的治疗常用放疗和化疗的方法, 但放疗和化疗对肿瘤细胞的杀伤选择性不强, 在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤了正常的细胞。而靶向药物也称导向药物则具有较强的选择性杀伤肿瘤细胞,通常利用融合蛋白技术将药物和能与病灶特异性结合的配基融合在构成融合蛋白, 目的蛋白可特异性的与靶细胞结合并将药物导向病灶杀伤、杀死肿瘤细胞达到治疗目的。靶向药物的“生物弹头”常以绿脓杆菌外毒素和白喉毒素最多。国内外已成功构建了许多这类的融合蛋白, 在研究中显示了较好的疗效。

106 离子交换层析的原理是什么?（答案）

离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多; 在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。

离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。

107 原核和真核基因组比较：

原核基因组的特点：

①为一条环状双链DNA；②只有一个复制起点；③具有操纵子结构，多顺反子；④绝大部分为单拷贝；⑤基因一般是连续的，无内含子；⑥重复序列很少。

真核基因组的特点：

①真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；②基因组DNA与蛋白质结合成染色体，储存于细胞核内；③真核基因为单顺反子；④真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；⑤存在大量的重复序列；⑥功能相关的基因构成各种基因家族；⑦存在可移动的遗传因素。

108 蓝-白筛选原理？

某些载体带有大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因片段，在β-半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入一段多克隆位点（MCS）。如果克隆位点上没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的β-半乳糖苷酶基因将正常表达，产生有活性的β-半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成β-半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。

109. RNAi 和反义RNA 技术：

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制。 RNAi的机制可能是双链RNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下，被切割成21-23 bp大小的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs结合一个核酶复合物形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活的RISC可以精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。

由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。

双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。

反义RNA（antisense RNA）也称干扰mRNA的互补RNA（mRNA interfering complementary RNA， mic RNA）。碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA称为反义RNA。它可通过与靶部位序列互补而与之结合，或直接阻止其功能，或改变靶部位构象而影响其功能。可以作为一种调控特定基因表达的手段。

反义RNA 技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA ，然后转染受体细胞，则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA ，与相应的mRNA 互补结合，从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达，对基因的表达进行调控。

110. RNA干扰机理 miRNA (microRNA, 微小RNA) 与 siRNA (small interference RNA, 小型干扰RNA)的区别

RNA干扰是由长链型、完全型或不完全型双链RNA激活的，这些双链RNA被识别并被一种叫做“Dicer”的RNA酶III进行特异性剪切，得到21–26个核苷酸的小型双链。然后这些小型双链RNA以单链RNA的形式被识别、解链和重组为RISC (RNA诱导沉默蛋白复合体)，降解同源mRNA。

第一，微小RNA 起源于明显不同于其他识别基因的基因位点，而小型干扰RNA通常起源于信使RNA、转座子、病毒或异染色质的 DNA。

第二，微小RNA由能形成局部RNA 发夹结构的转录体加工而成，而小型干扰RNA 由长链双分子RNA双链体或拓展发夹结构加工而成。

第三， 单个“微小RNA：微小RNA”双链体起源于每个微小RNA发夹结构的前体分子, 而小型干扰RNA 双链体集合体起源于每个小型干扰RNA前体分子，导致了许多不同的小型干扰RNA在这种拓展型的双链RNA的双链上聚合。

第四，相关生物中的微小RNA序列几乎总是保守的，而外源小型干扰RNA 序列很少是保守。

第五，关于微小RNA 和外源小型干扰RNA的生物靶标方面，外源小型干扰RNA是典型的 “自动沉默”，也就是它们在其起源的同一位点(或非常相似的位点)沉默，而微小RNA 是“异位沉默”，也就是它们是由具备非常不同的沉默的基因产生的。

111基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法。酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理？如何用此方法检测样品中的抗原和抗体？运用免疫学的方法能开展哪些分子生物学研究？

（1）ELISA：主要是基于抗原或抗体能吸附至固相载体的表面并保持其免疫活性，抗原或抗体与酶形成的酶结合物仍保持催化活性的基本原理，通过酶活力测定来确定抗原（或抗体）含量，常用于快速筛查和定量一个抗原在样品中的存在。主要步骤：待测样品中的蛋白质被吸附到惰性表面，表面加非特异性蛋白质一起温育，封闭未被蛋白质覆盖的部位，以防止随后步骤中的蛋白质被吸附到表面。然后用含抗待测蛋白质的抗体（第一抗体）的溶液处理，未被结合的抗体用缓冲液洗去。表面再用含抗第一抗体的抗体（第二抗体）的溶液处理，未被结合的第二抗体洗去。第二抗体是与一个催化形成有色产物的酶共价连接的。最后加入与第二抗体偶联的酶的底物，底物被酶催化变为有色产物，有色产物的产量与样品中待测的抗原（或抗体）含量成正比，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

（2）Western blot：在操作上类似于用于核酸分析的Southern或Northern blot，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。先将蛋白质样品用PAGE分离，然后凝胶板与硝酸纤维膜贴在一起，进行电泳转移，将凝胶上的蛋白条带转印到纤维膜上。将纤维膜封闭，然后相继用第一抗体、标记的第二抗体处理。经过底物显色或放射自显影，只有含待测蛋白质的条带显示颜色。免疫印迹能检测样品种中的微量成分和近似相对分子质量。

（3）亲和层析：利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。