öλÔÓéÀֵǼÈë¿ÚÏÂÔØ

Ìì½ò¿Æ¼¼´óѧ·Ö×ÓÉúÎïѧ¸´Ï°×ܽá(8)

±¾Õ¾Ð¡±à Ãâ·ÑöλÔÓéÀÖ¹Ù·½appÏÂÔØÍø/2015-09-20


pSC101ÖÊÁ£ÓпɲåÈëÍâÔ´DNAµÄ¶à¸öÄÚÇÐøµ¥¿Ë¡λµãºÍËÄ»·ËØ¿¹ÐÔǿѡÔñ¼ÇºÅ£¬ÊǵÚÒ»¸öÕæºË»ùÒò¿ËÂ¡ÔØÌå¡£
ȱµã£ºËüÊÇÒ»ÖÖÑϽôÐ͸´ÖÆ¿ØÖƵĵͿ½±´ÖÊÁ££¬´Ó´øÓиÃÖÊÁ£µÄ¼ÄÖ÷ϸ°ûÖÐÌáÈ¡pSC101 DNA£¬²úÁ¿ºÜµÍ¡£
2£©ColE1ÖÊÁ£ÔØÌå
ColE1ÖÊÁ£ÊôÓÚËɳÚÐ͸´ÖÆ¿ØÖƵĶ࿽±´ÖÊÁ£¡£Õý³£Éú³¤Ìõ¼þÏ£¬µ±ÅàÑø»ùÖа±»ùËá±»ºÄ¾¡£¬»òÊÇÔÚ¶ÔÊýÉú³¤Ä©ÆÚµÄϸ°ûÅàÑøÎïÖмÓÈëÂÈÃ¹ËØÒÔÒÖÖÆµ°°×ÖʵĺϳÉ£¬¼ÄÖ÷ȾɫÌåDNAµÄ¸´ÖƱ㱻ÒÖÖÆ£¬Ï¸°ûµÄÉú³¤Ò²ËæÖ®Í£Ö¹¡£
ËɳÚÐ͸´ÖÆ¿ØÖƵÄÖÊÁ£DNAÈÔÈ»¿ÉÒÔ¼ÌÐø½øÐи´ÖÆ´ïÊýСʱ֮¾Ã£¬Ê¹Ã¿¸ö¼ÄÖ÷ϸ°ûÖÐËùÀÛ»ýµÄColE1ÖÊÁ£¿½±´ÊýÔö¼Óµ½1000-3000¸öÖ®¶à£¬ÖÊÁ£DNA´óÔ¼¿Éռϸ°û×ÜDNAµÄ50%×óÓÒ¡£
3£©pBR322ÖÊÁ£ÔØÌå
ÓÉÈý¸ö²»Í¬À´Ô´µÄ²¿·Ö×é³ÉµÄ£ºµÚÒ»²¿·ÖÀ´Ô´ÓÚpSF2124ÖÊÁ£Ò×λ×ÓTn3µÄ°±ÜÐÇàÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò£¨ampr£©£»
µÚ¶þ²¿·ÖÀ´Ô´ÓÚpSC101ÖÊÁ£µÄËÄ»·ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò£¨tetr£©£»
µÚÈý²¿·ÖÔòÀ´Ô´ÓÚColE1µÄÅÉÉúÖÊÁ£pMB1µÄDNA¸´ÖÆÆðµã£¨ori£©¡£
ÓŵãÊǾßÓнÏСµÄ·Ö×ÓÁ¿£¬Æä³¤¶ÈΪ4 363bp¡£²»½öÒ×ÓÚ´¿»¯£¬¶øÇÒ¼´Ê¹Ð¯´øÉÏÒ»¶Î6-8kbµÄÍâÔ´DNAƬ¶Î£¬²Ù×÷ÆðÀ´ÈÔ½ÏΪ±ãÀû¡£
¾ßÓÐÁ½ÖÖ¿¹ÉúËØ¿¹ÐÔ»ùÒòÒÔÓÃ×÷ת»¯×ÓµÄÑ¡Ôñ¼ÇºÅ¡£ÓнϸߵĿ½±´Êý£¬Èô¾­¹ýÂÈÃ¹ËØÀ©Ôö£¬Ã¿¸öϸ°ûÖпÉÀÛ»ý1000~3000¸ö¿½±´£¬ÎªÖØ×éÌåDNAµÄÖÆ±¸ÌṩÁ˼«´óµÄ·½±ã¡£
½«ÍâÔ´DNAƬ¶Î¿Ë¡ÔÚpBR322ÖÊÁ£µÄBamHI»òSalIλµãÉÏ£¬ÓÉÓÚ×è¶ÏÁËtetr»ùÒò±àÂëÐòÁеÄÁ¬ÐøÐÔ£¬Ê¹Æäʧȥ»îÐÔ£¬²úÉúÁ˾ßÓÐAmprTets±íÐ͵ÄÖØ×éµÄpBR322ÖÊÁ£¡£
4£©pUCÖÊÁ£ÔØÌ壨°üÀ¨Ëĸö²¿·Ö£©
(i)À´×ÔpBR322ÖÊÁ£µÄ¸´ÖÆÆðµã£¨ori£©£»(ii)°±ÜÐÇàÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò£¨ampr£©£»(iii)´ó³¦¸Ë¾úβ-°ëÈéÌÇø»ùÒò£¨lacZ£©µÄÆô¶¯×Ó¼°Æä±àÂëα-ëÄÁ´µÄDNAÐòÁУ¬´Ë½á¹¹ÌسÆÎªlacZ’»ùÒò£»
(iv)λÓÚlacZ ’»ùÒòÖеĿ¿½ü5’-¶ËµÄÒ»¶Î¶à¿Ë¡λµã£¨MCS£©Çø¶Î£¬ÍâÔ´»ùÒò²åÈëºóÆÆ»µÁËlacZ ’»ùÒòµÄ¹¦ÄÜ¡£
Óŵ㣺¸üСµÄ·Ö×ÓÁ¿ºÍ¸ü¸ßµÄ¿½±´Êý¡£ÔÚpBR322»ù´¡ÉϹ¹½¨pUCÖÊÁ£ÔØÌåʱ£¬½ö±£ÁôÏÂÆäÖеݱÜÐÇàÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò¼°¸´ÖÆÆðµã£¬Æä·Ö×ÓСÁËÐí¶à£¬pUC8Ϊ2750bp£¬pUC18Ϊ2686bp¡£ÓÉÓÚȱʧrop»ùÒò£¬pUCÖÊÁ£²»¾­ÂÈÃ¹ËØÀ©Ôöʱ£¬Æ½¾ùÿ¸öϸ°û¼´¿É´ï500~700¸ö¿½±´¡£
¿ÉÓÃ×éÖ¯»¯Ñ§·½·¨¼ì²âÖØ×éÌå¡£pUC8ÖÊÁ£½á¹¹ÖоßÓÐÀ´×Դ󳦸˾úlac²Ù×Ý×ÓµÄlacZ'»ùÒò£¬Ëù±àÂëµÄα-ëÄÁ´¿É²ÎÓëα-»¥²¹×÷Óá£Òò´Ë£¬¿ÉÓÃX-galÏÔÉ«·¨ÊµÏÖ¶ÔÖØ×éÌåת»¯×ӵļø¶¨¡£
¾ßÓжà¿Ë¡λµãMCSÇø¶Î£¬¿ÉÒ԰ѾßÁ½ÖÖ²»Í¬Õ³ÐÔÄ©¶Ë£¨ÈçEcoRIºÍBamHI£©µÄÍâÔ´DNAƬ¶ÎÖ±½Ó¿Ë¡µ½pUC8ÖÊÁ£ÔØÌåÉÏ¡£
5£©pGEM-3ZÖÊÁ£
³¤¶ÈΪ2743bp£¬±àÂëÓÐÒ»¸ö°±ÜÐÇàÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒòºÍÒ»¸ölacZ'»ùÒò¡£
º¬ÓÐÁ½¸öÊɾúÌåÆô¶¯×Ó£¨T7ºÍSP6£©£¬ÎªRNA¾ÛºÏøµÄ¸½×Å×÷ÓÃÌṩÁËÌØÒìÐÔµÄʶ±ðλµã¡£¼ÓÈëT7»òSP6 RNA¾ÛºÏø£¬Ëù¿Ë¡µÄÍâÔ´»ùÒò±ã»áת¼³öÏàÓ¦µÄmRNA¡£
6£©´©ËóÖÊÁ£ÔØÌ壨shuttle plasmid vector£©
Ö¸ÓÉÈ˹¤¹¹½¨µÄ¾ßÓÐÁ½ÖÖ²»Í¬¸´ÖÆÆðµãºÍÑ¡Ôñ¼ÇºÅ£¬¿ÉÔÚÁ½ÖÖ²»Í¬µÄ¼ÄÖ÷ϸ°ûÖдæ»îºÍ¸´ÖƵÄÖÊÁ£ÔØÌå¡£ÓÉÓÚÕâÀàÖÊÁ£ÔØÌå¿ÉÒÔ±£Ö¤ÍâÔ´DNAÐòÁÐÔÚ²»Í¬ÎïÖÖµÄϸ°ûÖ®¼äµÃµ½À©Ôö£¬ÄÜÔÚÔ­ºËºÍÕæºËϸ°ûÖ®¼äÍù·µ´©Ë󣬾ßÓй㷺µÄÓÃ;¡£
5. 3. 3 λÊɾúÌåÔØÌå
ÊɾúÌå¿ÉÔÚÍÑÀë¼ÄÖ÷ϸ°ûµÄ״̬ϱ£³Ö×Ô¼ºµÄÉúÃü£¬µ«Ò»µ©ÍÑÀëÁ˼ÄÖ÷ϸ°û£¬¾Í¼È²»ÄÜÉú³¤Ò²²»Äܸ´ÖÆ£¬ÒòΪ´ó¶àÊýµÄÊɾúÌåÖ»ÄÜÀûÓüÄÖ÷ºËÌÇÌå¡¢ºÏ³Éµ°°×ÖʵÄÒò×Ó¡¢¸÷ÖÖ°±»ùËá¼°ÄÜÁ¿´úлÌåϵ½øÐÐÉú³¤ºÍÔöÖ³¡£
·ÖΪÈܾúÖÜÆÚºÍÈÜÔ´ÖÜÆÚÁ½ÖÖ²»Í¬µÄÀàÐÍ¡£
ÔÚÈܾúÖÜÆÚ£¬ÊɾúÌ彫Æä¸ÐȾµÄ¼ÄÖ÷ϸ°ûת±ä³ÉΪÊɾúÌåµÄ“ÖÆÔì³§”£¬²úÉú³ö´óÁ¿µÄ×Ó´úÊɾúÌå¿ÅÁ£¡£½«Ö»¾ßÓÐÈܾúÉú³¤ÖÜÆÚµÄÊɾúÌå½Ð×÷ÁÒÐÔÊɾúÌå¡£
ÈÜÔ´Éú³¤ÖÜÆÚÊÇÖ¸ÔÚ¸ÐȾ¹ý³ÌÖÐûÓвúÉú³ö×Ó´úÊɾúÌå¿ÅÁ££¬ÊɾúÌåDNA±»ÕûºÏµ½¼ÄÖ÷ϸ°ûȾɫÌåDNAÉÏ£¬³ÉΪËüµÄÒ»¸ö×é³É²¿·Ö¡£¾ßÓÐÕâÖÖÈÜÔ´ÖÜÆÚµÄÊɾúÌ壬½Ð×÷κÍÊɾúÌå¡£
λÊɾúÌåµÄ·Ö×ÓÁ¿Îª48.5kb£¬ÊÇκÍÊɾúÌå¡£
λÊɾúÌåÓÐ61¸ö»ùÒò£¬ÆäÖÐÔ¼Ò»°ë²ÎÓëÁËÉúÃüÖÜÆÚµÄµ÷¿Ø£¬ÊÇλÊɾúÌåµÄ±ØÐè»ùÒò£»ÁíÒ»²¿·Ö»ùÒòÔò±»³ÆÎª·Ç±ØÐè»ùÒò£¬±»ÍâÔ´»ùÒòÈ¡´úºó²»Ó°ÏìÉúÃüÖÜÆÚ¡£
ÔÚλÊɾúÌåÏßÐÔDNA·Ö×ÓµÄÁ½¶Ë£¬¸÷ÓÐÒ»ÌõÓÉ12¸öºËÜÕËá×é³ÉµÄÍêÈ«»¥²¹µÄ5‘Í»³öÐòÁУ¨¼´Õ³ÐÔÄ©¶Ë£©£¬×¢Èëµ½¼ÄÖ÷ϸ°ûÄÚµÄλÊɾúÌåµÄÏßÐÔDNA·Ö×Ó£¬»áѸËÙµØÍ¨¹ýÕ³ÐÔÄ©¶ËÖ®¼äµÄ»¥²¹×÷Óã¬Ðγɻ·ÐÎË«Á´DNA·Ö×Ó£¬²¢½øÒ»²½³¬ÅÌÈÆ¡£
ÕâÖÖÕ³ÐÔÄ©¶Ë½áºÏÐγɵÄË«Á´Çø¶Î³ÆÎªcosλµã£¨cohesive-end site£©¡£
5. 3. 5 pBluescriptÊɾúÁ£ÔØÌå
pBluescriptÊÇÖ¸ÓÉStratagene¹«Ë¾·¢Õ¹µÄÒ»Àà´ÓpUCÔØÌåÅÉÉú¶øÀ´µÄÊɾúÁ£ÔØÌ壬¼ò³ÆÎªpBS£¨+/-£©£¬Èç½ñÔò¸ü¶àµØ½Ð×÷pBluescript KS£¨+/-£©»òpBluescript SK£¨+/-£©¡£
(i)ÔÚ¶à¿Ë¡λµãÇø£¨MCS£©µÄÁ½²à£¬´æÔÚÒ»¶ÔT3ºÍT7ÊɾúÌåµÄÆô¶¯×Ó£¬ÓÃÒÔ¶¨ÏòÖ¸µ¼²åÈëÔÚ¶à¿Ë¡λµãÉϵÄÍâÔ´»ùÒòµÄת¼»î¶¯£»
(ii)¾ßÓе¥Á´ÊɾúÌåM13»òf1µÄ¸´ÖÆÆðµãºÍÒ»¸öÀ´×ÔColE1ÖÊÁ£µÄ¸´ÖÆÆðµã£¬±£Ö¤pBluescriptÊɾúÁ£ÔØÌåÔÚÓлòÎÞ¸¨ÖúÊɾúÌå¹²¸ÐȾµÄ²»Í¬Çé¿öÏ£¬°´ÕÕ²»Í¬µÄ¸´ÖÆÐÎʽ·Ö±ðºÏ³É³öµ¥Á´»òË«Á´DNA£»
(iii£©±àÂëÓÐÒ»¸ö°±ÜÐÇàÃ¹ËØ¿¹ÐÔ»ùÒò£¬×÷Ϊת»¯×Ó¿Ë¡µÄÑ¡Ôñ±ê¼Ç£»
(iv)º¬ÓÐÒ»¸ölacZ»ùÒò£¬¿ÉÒÔ°´ÕÕX-gal-IPTG×éÖ¯»¯Ñ§ÏÔÉ«·¨É¸Ñ¡ÊɾúÁ£ÔØÌåµÄÖØ×é×Ó¡£
5. 4 »ùÒòµÄ·ÖÀëÓë¼ø¶¨
ÔÚ¶àϸ°ûµÄ¸ßµÈÉúÎï¸öÌåˮƽÉÏ£¬ÈËÃÇÓÿË¡£¨clone£©±íʾÓɾßÓÐÏàͬ»ùÒòÐ͵ÄͬһÎïÖÖµÄÁ½¸ö»òÊý¸ö¸öÌå×é³ÉµÄȺÌå¡£´ÓͬһÊܾ«ÂÑ·ÖÁѶøÀ´µÄµ¥ÂÑË«Éú×Ó£¨monozygotic twins£©±ãÊÇÊôÓÚͬһ¿Ë¡¡£
ÔÚϸ°ûˮƽÉÏ£¬¿Ë¡һ´ÊÊÇÖ¸ÓÉͬһ¸ö×æÏ¸°û£¨progenitor cell£©·ÖÁѶøÀ´µÄһȺÒÅ´«ÉÏͬһµÄ×Óϸ°ûȺÌå¡£
ÔÚ·Ö×ÓÉúÎïѧÉÏ£¬ÈËÃǰѽ«ÍâÔ´DNA²åÈë¾ßÓи´ÖÆÄÜÁ¦µÄÔØÌåDNAÖУ¬Ê¹Ö®µÃÒÔÓÀ¾Ã±£´æºÍ¸´ÖÆÕâÖÖ¹ý³Ì³ÆÎª¿Ë¡¡£
»ùÒò¿Ë¡£¬°üÀ¨Ä¿µÄ»ùÒòµÄ·ÖÀëºÍ¼ø¶¨Á½¸öÄÚÈÝ£¬·ÖËĸö»ù±¾²½Ö裺
(1) DNA²ÄÁϵÄÑ¡ÔñÓëÆ¬¶Î»¯£»
(2) ÍâÔ´DNAƬ¶ÎÓëÔØÌå·Ö×ÓµÄÌåÍâÁ¬½Ó·´Ó¦£»
(3) ½«È˹¤ÖØ×éµÄDNA·Ö×Óµ¼ÈëËüÃÇÄܹ»½øÐÐÕý³£¸´ÖƵļÄÖ÷ϸ°û£»
(4) ÖØ×éת»¯×Ó¿Ë¡µÄÑ¡Ôñ»òɸѡ¡£
5. 4. 1 DNAƬ¶ÎµÄ²úÉúÓë·ÖÀë
ÓÉÓڸߵÈÕæºËÉúÎïµÄ»ùÒò×éÅӴ󣬰´Ò»°ãÔØÌå³ÐÊÜÍâÔ´DNA²åÈëÄÜÁ¦£¨´óԼΪ1000~3000bp£©¼ÆË㣬ÄܲúÉú¼¸Ê®Íò¸ö´óС²»Í¬µÄDNAƬ¶Î£¬ÐγÉÓɼ¸Ê®Íò¸ö´óС²»Í¬µÄÖØ×éÌå·Ö×Ó×é³ÉµÄ¿Ë¡ȺÌå¡£
5. 4. 2 ÖØ×éÌåDNA·Ö×ӵĹ¹½¨
1)ÍâÔ´DNAƬ¶Î¶¨Ïò²åÈëÔØÌå·Ö×Ó
ÓÃÁ½ÖÖ²»Í¬µÄÏÞÖÆÐÔºËËáÄÚÇÐøͬʱÏû»¯Ìض¨µÄDNA·Ö×Ó£¬½«²úÉú²»Í¬Õ³ÐÔÄ©¶ËµÄDNAƬ¶Î¡£Èç¹ûÔØÌå·Ö×Ӻʹý¿Ë¡µÄDNA·Ö×Ó¶¼ÓÃͬһ¶ÔÏÞÖÆÐÔºËËáÄÚÇÐøÇиî£¬ÔØÌåºÍÍâÔ´DNAƬ¶Î½«°´Ò»ÖÖÈ¡ÏòÁ¬³ÉÖØ×éDNA·Ö×Ó£¬±£Ö¤ÍâÔ´DNAƬ¶Î¶¨Ïò²åÈëÔØÌå·Ö×Ó¡£
ÔØÌå·Ö×ÓºÍÍâÔ´DNA²åÈëÆ¬¶Î£¨»ò³Æ¹©ÌåDNA£©£¬²¢²»Ò»¶¨×ÜÄܲúÉú³ö»¥²¹µÄÕ³ÐÔÄ©¶Ë£¬ËùÒÔ£¬ÓÐʱ²ÉÓÃÆ½Ä©¶ËÁ¬½Ó·¨»ò²ÉÓø½¼ÓÏνÓÎïµÄ°ì·¨À´Ìá¸ßƽĩ¶ËÖ®¼äµÄÁ¬½ÓЧÂÊ¡£
2)ÖØ×é×Óµ¼ÈëÊÜÌåϸ°ûµÄ;¾¶
½«ÍâÔ´ÖØ×éÌå·Ö×Óµ¼ÈëÊÜÌåϸ°ûµÄÖ÷Ҫ;¾¶°üÀ¨×ª»¯£¨»òתȾ£©¡¢×ªµ¼¡¢ÏÔ΢עÉäºÍµç´©¿×µÈ¡£×ª»¯ºÍתµ¼Ö÷ÒªÊÊÓÃÓÚϸ¾úÒ»ÀàÔ­ºËϸ°ûºÍ½ÍĸµÈµÍµÈÕæºËϸ°û£¬¶øÏÔ΢עÉäºÍµç´©¿×ÔòÖ÷ÒªÓ¦ÓÃÓڸߵȶ¯ÎïµÄÕæºËϸ°û¡£
5. 4. 3 cDNA»ùÒò¿Ë¡
ÕæºËÉúÎï»ùÒò×éÅӴ󣬺¬ÓдóÁ¿Öظ´ÐòÁС£ÎÞÂÛÊǵçÓ¾·ÖÀë¼¼Êõ»¹ÊÇͨ¹ýÔÓ½»µÄ·½·¨£¬¶¼ÄÑÒÔÖ±½Ó·ÖÀ뵽ĿµÄ»ùÒòƬ¶Î¡£
¾¡¹Ü¸ßµÈÉúÎïÒ»°ã¾ßÓÐ3-5ÍòÖÖ×óÓÒ²»Í¬µÄ»ùÒò£¬ÔÚµ¥¸öϸ°û»ò×éÖ¯µÄÌØ¶¨Ê±¼ä¶ÎÖУ¬½öÓÐ15-20%×óÓҵĻùÒòµÃÒÔ±í´ï¡£
cDNA¿Ë¡µÄ»ù±¾¹ý³ÌÊÇͨ¹ýһϵÁÐø´ß×÷Óã¬Ê¹×Üpoly£¨A£©mRNAת±ä³ÉË«Á´cDNAȺÌå²¢²åÈëµ½Êʵ±µÄÔØÌå·Ö×ÓÉÏ£¬×ª»¯´ó³¦¸Ë¾ú¼ÄÖ÷¾úÖêϸ°û£¬¹¹³É°üº¬ËùÓлùÒò±àÂëÐòÁеÄcDNA»ùÒòÎĿ⡣
¿ÉÓ¦ÓÃPromega PolyAT tract mRNA ·ÖÀëϵͳ·ÖÀë¶à¾Û(A)mRNA¡£½«ÓÃÉúÎïËØ±ê¼ÇµÄ¹Ñ¾Û(dT)ÒýÎïÓëϸ°û×ÜRNA¹²ÎÂÓý£¬¼ÓÈëÓë΢´ÅÇòÏàÁ¬µÄ¿¹ÉúÎïËØµ°°×£¬Óôų¡Îü¸½Í¨¹ý¹Ñ¾Û(dT)ÒýÎïÓ뿹ÉúÎïËØµ°°×¼°Ç¿Á¦Î¢´ÅÇòÏàÁ¬µÄmRNA¡£
µÍ·á¶ÈmRNA£¬Ã¿¸öϸ°û½öÓÐ14¸ö¿½±´×óÓÒ£¬Æä×ÜÁ¿Ô¼Õ¼×ÜmRNAµÄ30%£¬ÆäÖÐÔ¼ÓÐ11000¸ö×óÓҵIJ»Í¬ÖÖÀàµÄmRNA¡£ÎªÁË»ñµÃÄܹ»´ú±íÈ«²¿µÍ·á¶ÈmRNAÐòÁеÄcDNA»ùÒòÎĿ⣬ÀíÂÛ×îµÍ¿Ë¡ÊýÊÇ11000/0.30=~37 000¡£ÊµÑéÖÐΪʹµÍ·á¶ÈmRNAµÄcDNA¿Ë¡´ïµ½99%µÄÆÚÍûÂÊ£¬ÐèҪɸѡ170 000¸ö¿Ë¡×Ó¡£
5. 4. 4 ¿Ë¡»ùÒòµÄ·ÖÀë
1)Ó¦ÓúËËá̽Õë¿Ë¡ĿµÄ»ùÒò¡£
°Ñ»ùÒòÎÄ¿â×ªÒÆµ½ÄáÁúĤ»òÏõËáÏËÎ¬ËØÂËĤÉÏ£¬¾Í¿ÉÒÔÓëÌØÒìÐԵĺËËá̽Õë½øÐоúÂä»òÊɾú°ßÔÓ½»£¬ÒÔ±ãɸѡ³ö¾ßÓÐÄ¿µÄ»ùÒòµÄÑôÐÔ¿Ë¡£¬Õâ¸ö¹ý³Ì½Ð×÷¿Ë¡»ùÒòµÄ·ÖÀë»òɸѡ¡£
2)Ó¦ÓÃmRNA²î±ðÏÔʾ¼¼Êõ¿Ë¡ĿµÄ»ùÒò¡£
²»Í¬»ùÒòÔÚÉúÎï¸öÌå·¢ÓýµÄ²»Í¬½×¶Î»ò²»Í¬µÄ×éÖ¯¡¢Ï¸°ûÖз¢ÉúµÄ°´Ê±¼ä¡¢¿Õ¼ä½øÐÐÓÐÐò±í´ïµÄ·½Ê½³ÆÎª»ùÒòµÄ²î±ð±í´ï£¨differential expression£©¡£
1992Ä꣬ÃÀ¹ú²¨Ê¿¶ÙDena-Farber°©Ö¢Ñо¿ËùµÄ¿ÆÑ§¼ÒP. LiangºÍA. D. Pardee·¢Ã÷ÁËmRNAµÄ²î±ðÏÔʾ£¨mRNA differential display£©¼¼Êõ£¬¼ò³ÆDDRT-PCR£¬¿ÉÒÔ´ÓÒ»¶Ô²»Í¬»ùÒòÐ͵Äϸ°ûȺÌåËù²úÉúµÄÔ¼15 000ÖÖmRNAÖÐÓÐЧµØ¼ø¶¨²¢·ÖÀë³ö²î±ð±í´ïµÄ»ùÒò¡£
Éè¼ÆºÏ³ÉÁË12ÖÖÓÉ11¸ö»ò12¸öÁ¬ÐøµÄÍÑÑõÐØÜÕËá¼ÓÉÏÁ½¸ö3‘-¶Ë궨ÍÑÑõºËÜÕËá×é³ÉµÄ3'ÒýÎÓÃÒÔ·´×ªÂ¼mRNA£¬ºÏ³ÉµÚÒ»Á´cDNA¡£Ã¿Ò»ÖÖÈ˹¤ºÏ³ÉµÄ¹ÑºËÜÕËáÒýÎ¶¼Äܹ»°Ñ×ÜmRNAȺÌåµÄ1/12·Ö×Ó·´×ªÂ¼³ÉmRNA-cDNAÔӺϷÖ×Ó¡£
ÔÚDDRT-PCR·´Ó¦ÖУ¬³£ÓÃ3'-¶Ë궨ÒýÎïºÍ8-10-merµÄ5'-¶ËËæ»úÒýÎï×é³ÉµÄÒýÎï¶Ô£¬ÒÔµÚÒ»Á´cDNAΪģ°å½øÐÐPCRÀ©Ôö£¨Í¼5-29£©¡£
3)Ó¦ÓÃRDA·¨½øÐзÖ×Ó¿Ë¡
¸Ã·¨Í¨¹ý½µµÍcDNAȺÌ帴ÔÓÐԺ͸ü»»cDNAÁ½¶Ë½ÓÍ·µÈ·½·¨£¬ÌØÒìÐÔÀ©ÔöÄ¿µÄ»ùÒòƬ¶Î¡£ÒòΪTesterºÍDriverÔÚ½ÓÊܲîʾ·ÖÎöǰ¾ù¾­Ò»¸ö4¼î»ùÇиîø´¦Àí£¬ÐÎ³ÉÆ½¾ù³¤¶È256bpµÄ´ú±íȺ£¬±£Ö¤¾ø´ó²¿·ÖÒÅ´«ÐÅÏ¢Äܱ»À©Ôö¡£
ÿ´ÎT¼õD·´Ó¦ºó½öÉèÖÃ72¡æ¸´ÐÔÓëÑÓÉ죬94¡æ±äÐÔÕâÁ½¸ö²ÎÊý¹²20¸öPCRÑ­»·£¬PCR²úÎïµÄÌØÒìÐÔºÍËùµÃ̽ÕëµÄ´¿¶È·Ç³£¸ß£¨Í¼5-30£©¡£
4) Ó¦ÓýÍĸ˫ÔÓ½»Ìåϵ£¨Two-hybrid system£©¿Ë¡»ùÒò
ÕæºËÉúÎïµÄת¼Òò×Ó´ó¶àÊÇÓÉÁ½¸ö½á¹¹ÉÏ·Ö¿ª¡¢¹¦ÄÜÉ϶ÀÁ¢µÄ½á¹¹Óò×é³ÉµÄ¡£ÈçGAL4µÄN¶Ë1-147aaÊÇDNA½áºÏÓò£¨BD£©£¬ÆäC¶Ë768-881aaÊÇת¼¼¤»îÓò£¨AD£©¡£Ò»°ãÇé¿öÏ£¬BDÄÜÓëGAL4ЧӦ»ùÒòÆô¶¯×ÓÉÏÓεÄÌØ¶¨DNAÇø¶Î£¨UAS£©Ïà½áºÏ£¬ADÔòÍÆ¶¯ÁËת¼Æðʼ¡£
5) cDNA RACE(cDNAÄ©¶Ë¿ìËÙÀ©Ôö)
ÊÇÓÃÓÚ´ÓÒÑÖªcDNAƬ¶ÎÀ©ÔöÈ«³¤»ùÒòµÄ·½·¨£¬Ëü¸ù¾ÝÒÑÖªÐòÁÐÉè¼Æ»ùÒòƬ¶ÎÄÚ²¿ÌØÒìÒýÎÓÉ¸ÃÆ¬¶ÎÏòÍâ²à½øÐÐPCRÀ©ÔöµÃµ½Ä¿µÄÐòÁС£ÓÃÓÚÀ©Ôö5’¶ËµÄ·½·¨³ÆÎª5’RACE£¬ÓÃÓÚÀ©Ôö3’¶ËµÄ³ÆÎª3’RACE¡£
6) »ùÒòµÄͼλ¿Ë¡·¨£¨Map-based cloning£©
ËùÓоßÓÐijÖÖ±íÏÖÐ͵ĻùÒò¶¼¿ÉÒÔͨ¹ý¸Ã·½·¨¿Ë¡µÃµ½¡£Ê×ÏÈ£¬Í¨¹ý¹¹½¨ÒÅ´«Á¬ËøÍ¼£¬½«Ä¿µÄ»ùÒò¶¨Î»µ½Ä³¸öȾɫÌåµÄÌØ¶¨Î»µã£¬²¢ÔÚÆäÁ½²àÈ·¶¨½ôÃÜÁ¬ËøµÄRFLP»òRAPD·Ö×Ó±ê¼Ç¡£
ͨ¹ý¶ÔÐí¶à²»Í¬µÄÉú̬Ðͼ°´óÁ¿ÏÞÖÆÐÔÄÚÇÐøºÍÔÓ½»Ì½ÕëµÄ·ÖÎö£¬ÕÒ³öÓëÄ¿µÄ»ùÒò¾àÀë×î½üµÄRFLP±ê¼Ç£¬Í¨¹ýȾɫÌå²½ÒÆ¼¼Êõ½«Î»ÓÚÕâÁ½¸ö±ê¼ÇÖ®¼äµÄ»ùÒòƬ¶Î¿Ë¡²¢·ÖÀë³öÀ´¡£
¸ù¾Ý»ùÒò¹¦ÄÜ»¥×÷Ô­Àí¼ø¶¨Ä¿µÄ»ùÒò¡£ÔÚRFLP×÷ͼÖУ¬Á¬Ëø¾àÀëÊǸù¾ÝÖØ×éÂÊÀ´¼ÆËãµÄ£¬1cm£¨ÀåĦ£©Ï൱ÓÚ1%µÄÖØ×éÂÊ¡£ÈËÀà»ùÒò×éÖУ¬1cm≈1000kb£»ÄâÄϽæ²ËÖУ¬ 1cm≈290kb£»Ð¡ÂóÖУ¬1cm≈3500kb¡£
5. 4. 5ÕæºË»ùÒò±í´ïÑо¿·½·¨ÓëÓ¦ÓÃ
1)»ùÒòÇóý¼¼Êõ(Gene Knockout)
2)µ°°×ÖÊÏ໥×÷Óã¨Pull-down assay£©
3)µ¼µ¯Ò©Îï——Ò©Îïµ¼ÏòÖÎÁÆ
Ö×Áö»ò°©Ï¸°û±íÃæ³£¹ýÁ¿±í´ïÄ³Ð©ÌØÕ÷ÐÔµ°°×ÖÊ£¬¿É×÷ΪÖ×Áöµ¼ÏòÖÎÁƵÄ×÷ÓðС£½«¿¹ÌåµÄijЩ²¿·ÖÓëÍâ¶¾ËØÏàÁ¬½Ó£¬¾ÍÄܰѶ¾ËØÖ±½ÓË͵½²¡±äϸ°û±íÃæ£¬ÓÐЧµØÉ±ËÀ²¡±äϸ°û£¬±£»¤½¡¿µÏ¸°û¡£
4) ÓÃDNA΢ÁÐÕó¼¼Êõ(DNA Microarray) ½øÐлùÒò¿Ë¡
×î¼òµ¥µÄÀý×ÓÊÇÓûúеÊְѼ«Î¢Á¿£¨nanoliters£©µÄÒѾ­³ýÈ¥ÖеȻò¸ß¶ÈÖØ¸´ÐòÁеÄDNAÑùÆ·µãµ½²£Æ¬»òÆäËüÔØÌåÉϲ¢Ê¹Ö®ÓÀ¾Ã¹Ì¶¨£¬Óò»Í¬Ï¸°ûÖÜÆÚ·¢Óý½×¶ÎµÄcDNA×÷̽ÕëϵͳÐÔµØÑо¿Ï¸°ûÖÐÈκÎʱÆÚÌØÒì±í´ïµÄ»ùÒò¡£
Èô°ÑijһÉúÎïÌåÄÚÈ«²¿»ùÒò·Ö±ðµãµ½DNA΢ÁÐÕó»òÕß»ùÒòоƬÉÏ£¬ÔÙÓò»Í¬·¢Óý½×¶ÎµÄcDNAÓëÖ®ÔÓ½»£¬¾ÍÄÜÁ˽âijЩ»ùÒò¶ÔÌØ¶¨Éú³¤·¢Óý½×¶ÎµÄÖØÒªÐÔ¡£

Ïà¹Ø»°Ìâ/·Ö×ÓÉúÎïѧ

öλÔÓéÀÖ(xinhui)¹Ù·½ÍøÕ¾_öλÔÓéÀÖappÏÂÔØÈë¿Ú